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3D Nanoimaging
三維納米成像(3D Nanoimaging)和單分子跟蹤系統(tǒng)(升級Olympus 共焦顯微鏡)
Overview
在過去的幾年里,人們已經(jīng)設(shè)計了幾種方法來使用光學(xué)顯微鏡(STED,PALM,STORM)獲得具有納米分辨率的細(xì)胞特征圖像。這些方法雖然功能強大,但在檢測圖像中稀疏的納米結(jié)構(gòu)時效率很低。同時,它們也不足以探測納米級三維結(jié)構(gòu)中亞秒級的化學(xué)反應(yīng)動力學(xué),這些結(jié)構(gòu)是不斷移動和改變形狀的。
在納米成像方法達(dá)到超分辨率的情況下,激光束不會像光柵圖像那樣按照預(yù)定的模式掃描樣品。相反,激光掃描成像基于反饋算法,在掃描過程中,根據(jù)待成像物體的形狀連續(xù)地調(diào)整和確定激光束跟隨的路徑。該算法將激光光斑移動到離物體表面一定距離的位置,由于激光光斑的位置和離物體表面的距離是已知的參數(shù),所以利用這些參數(shù)來重建物體的形狀。
三維細(xì)胞結(jié)構(gòu)可以在幾秒鐘內(nèi)分辨率達(dá)到20-40納米,精度為2納米。
How it work?
使用SMT(Single-Molecule Tracking)納米成像的操作順序很簡單:首先,獲取感興趣區(qū)域的共焦圖像;然后,用戶識別要成像的對象。SMT納米成像通過開關(guān)激活,激光束位于距離物體中心100-200納米的位置。當(dāng)激光光斑接近待成像表面時,熒光量增加。然而,熒光強度的增加取決于距離以及熒光團的濃度和它們各自的量子產(chǎn)率。為了將距離效應(yīng)與濃度效應(yīng)分開,點的位置被迫垂直于表面振蕩。也就是說,熒光強度在振蕩過程中發(fā)生變化(圖1)。
Figure 1. 調(diào)制跟蹤技術(shù)示意圖。束點圍繞物體以圓形軌道運動,其與物體表面的距離以設(shè)定的頻率周期性地變化;通常,對于每個軌道,振蕩次數(shù)在8到32之間,取決于物體的大小。這些半徑的小振蕩被用來計算軌道的調(diào)制函數(shù),從中可以確定光斑與表面的距離。
調(diào)制函數(shù)定義為由于表面的局部熒光而使交替部分與平均部分之比。實際上,調(diào)制是PSF的空間導(dǎo)數(shù)與強度的比值。調(diào)制函數(shù)隨著離表面距離的函數(shù)呈準(zhǔn)線性增加,這一特性允許它用于確定沿軌道激光光斑離表面的距離。通過這種方法,計算并重建物體的橫向形狀。
Tracking Methodology | XY-axis using galvo-controlled mirrors Z-axis using piezo-controlled stage |
Maximum Resolution | 20 nm ± 2 nm |
Data Acquisition Frequency | 32 to 256 KHz |
Circular Orbit Frequency | 2 KHz |
Detector | Internal PMT of FV1000/FV1200 |
Detection Electronics | ISS Photon Counting Unit |
Computer | 3 GHz, 4GB RAM, 200 GB hard drive, 27" monitor (minimum specifications shown) |
Acquisition and Analysis Software | SimFCS by Globals Unlimited |
下面是納米成像單元及其與FV1000共焦顯微鏡的連接示意圖。開關(guān)盒允許用戶在標(biāo)準(zhǔn)操作模式下操作FV1000,或激活納米成像系統(tǒng)。在納米成像操作中,FV1000的振鏡通過國際空間站提供的電子設(shè)備進(jìn)行控制。該信號由FV1000的內(nèi)部探測器收集并轉(zhuǎn)移到ISS光子計數(shù)數(shù)據(jù)采集單元。使用FV1000的振鏡在XY平面上跟蹤分子,并通過壓電控制級在z軸上跟蹤分子。儀表控制、數(shù)據(jù)采集和顯示在單獨的計算機上完成。
右側(cè)部分包括儀器組件(PC、控制電子設(shè)備、掃描儀和激光發(fā)射器)。示意圖的左側(cè)部分包括ISS隨升級包提供的組件.
可參看文獻(xiàn):
Nanometer-scale Imaging by the Modulation Tracking Method
Lanzano, L., Digman, M.A., Fwu, P., Giral, H., Levi, M., Gratton, E.
J Biophotonics, 2011, 4(6), 415-24.
Measurement of Distance with the Nanoscale Precise Imaging by Rapid Beam Oscillation Method
Lanzano, L., Gratton, E.
Microsc Res Tech, 2012, 75(9), 1253-64.
Real-time Multi-Parameter Spectroscopy and Localization in Three-Dimensional Single-Particle Tracking
Hellriegel, C., Gratton, E.
J R Soc Interface, 2009, 6, Suppl 1:S3-14.
Real-time Nanomicroscopy Via Three-Dimensional Single Particle Tracking
Katayama, Y., Burkacky, O., Meyer, M., Bráuchle, C., Gratton, E., Lamb, D.C.
Chemphyschem, 2009, 10(14), 2458-64.
Distance Measurement by Circular Scanning of the Excitation Beam in the Two-Photon Microscope
Kis-Petikova, K., Gratton, E.
Microsc Res Tech, 2004, 63(1), 34-49.
TH-F120
在線折光儀PRB21
ParticleX TC
觀世
在線濁度計
CELL PAT
FS500全譜直讀光譜儀
OES1000
蜂鳥10X42
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