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xCELLigence?實時細(xì)胞分析（RTCA）DP儀器使用無創(chuàng)電阻抗監(jiān)測，以無標(biāo)簽的實時方式量化細(xì)胞增殖，形態(tài)變化和附著質(zhì)量。 DP模型與其他xCELLigence儀器的區(qū)別是其使用電子集成的Boyden室（CIM-Plate?16）進一步對細(xì)胞侵襲和遷移（CIM）進行動力學(xué)測量的能力。 DP儀器的三個支架允許三個獨立的電子16孔板并聯(lián)或彼此獨立地進行控制和監(jiān)控，從而實現(xiàn)多個用戶的**生產(chǎn)力。將儀器置于標(biāo)準(zhǔn)的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中，并通過連接到孵化器外部的控制單元（筆記本電腦）的電纜進行供電和控制。用戶友好的RTCA軟件允許與所有三個支架實時接口，并包括實時數(shù)據(jù)顯示和分析功能。

細(xì)胞阻抗說明

在細(xì)胞生物化學(xué)測定和全身生物體內(nèi)實驗之間定位，基于細(xì)胞的測定是基礎(chǔ)和應(yīng)用生物學(xué)研究不可缺少的工具。然而，許多基于細(xì)胞的測定法的用途通過以下方式減少了：（1）需要使用標(biāo)記；（2）與連續(xù)監(jiān)測不相容（即僅產(chǎn)生終點數(shù)據(jù)）；（3）與正交試驗不相容；和（ 4）無法提供客觀/定量的讀數(shù)。然而，這些缺點都是通過非侵入性的，無標(biāo)記的和實時的細(xì)胞阻抗測定來克服的。 細(xì)胞阻抗測定的功能單元是融合到微量滴定板孔的底部表面的一組金微電極（圖1）。當(dāng)浸沒在導(dǎo)電溶液（如緩沖液或標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)基）中時，在這些電極上施加電位會使電子離開負(fù)極，通過本體溶液，然后沉積到正極端以完成電路。因為這種現(xiàn)象取決于電極與本體溶液相互作用，所以在電極 - 溶液界面處的粘附細(xì)胞的存在阻礙了電子流動。該阻抗的大小取決于細(xì)胞的數(shù)量，細(xì)胞的大小和形狀以及細(xì)胞 - 基底附著質(zhì)量。重要的是，金微電極表面和施加的電位（22 mV）都不影響細(xì)胞的健康或行為。

圖1.細(xì)胞阻抗裝置概述在單元格添加之前和之后顯示單個孔的側(cè)視圖。電極和電池都不被拉伸（為了清晰起見，它們被放大）。在不存在電池的情況下，電流自由流動通過培養(yǎng)基，完成電極之間的電路。由于細(xì)胞在電極上粘附并增殖，電流流動受阻，提供了細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞大小/形態(tài)以及細(xì)胞 - 基質(zhì)附著質(zhì)量的非常靈敏的讀數(shù)。

阻抗電極

ACEA E-Plate板中每孔中的金微電極生物傳感器覆蓋70-80％的表面積（取決于是否存在視野區(qū)域）。而不是圖1所示的簡化的電極對，E-Plate板的每個孔中的電極被連接成形成交錯陣列的“線”（圖2）。這種布置可以同時監(jiān)測細(xì)胞群體，從而提供精確的靈敏度：附著于板的細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞的大小/形態(tài)以及細(xì)胞 - 基質(zhì)附著質(zhì)量。

圖2. ACEA E-Plate板上的阻抗電極。 （A）E-Plate板的每個孔中使用的叉指電極的簡化示意圖。電極沒有按比例繪制（僅顯示一些電極，為了清晰起見，它們已被放大）。雖然細(xì)胞也可以在金電極表面上可視化，但在中間的無電極區(qū)域有助于顯微成像（亮場，熒光等）。 （B）16孔E-Plate板中單孔的照片。 （C）放大陰影電極和未染色人體細(xì)胞的明場圖像。 （D）復(fù)合顯微鏡中觀察到的金電極和結(jié)晶紫染色的人細(xì)胞。

用于實時細(xì)胞遷移/浸潤的設(shè)備

盡管它可以與其他xCELLigence儀器一樣運行測試，但是xCELLigence RTCA DP模型具有使用ACEA CIM-Plate進行實時細(xì)胞侵襲/遷移測定的附加功能，該實驗基本上是電子集成的Boyden室。如圖3A所示，將細(xì)胞直接置于微孔膜的頂部（遷移測定）上或在預(yù)先沉積在膜上的基底膜基質(zhì)和/或細(xì)胞單層的頂部（入侵測定）上放置在上室中。移動到下腔室的化學(xué)引誘劑，細(xì)胞通過微孔膜，然后沉積到金阻抗電極上（在本技術(shù)概述的前兩節(jié)中描述）。這提供了細(xì)胞遷移/侵襲的非常靈敏和可重復(fù)的連續(xù)動力學(xué)記錄（圖3B）。使用顯微成像定量遷移細(xì)胞的平行測定證明了CIM-Plate的阻抗信號與已經(jīng)遷移的細(xì)胞數(shù)量之間的**相關(guān)性。

圖3.細(xì)胞侵襲/遷移的定量實時分析。 （A）CIM板細(xì)節(jié)。上圖顯示了CIM-Plate八孔的剖視圖。下圖中的放大圖示出了單個孔的上部和下部室。上室的底表面由細(xì)胞可以遷移穿過的微孔膜組成。該膜下側(cè)的金電極檢測粘附細(xì)胞的存在。對于簡單的遷移測定（本文未示出），被監(jiān)測的細(xì)胞將直接電鍍在膜上。對于入侵測定（在此顯示），將細(xì)胞鋪在基底膜基質(zhì)，細(xì)胞單層或其某些組合的頂部。 （B）在存在或不存在化學(xué)引誘物的情況下實時分析鼠巨噬細(xì)胞遷移。在沒有細(xì)胞（陰性對照;藍(lán)線）的情況下，阻抗信號在測定的75分鐘內(nèi)不變。雖然一些細(xì)胞在不存在化學(xué)引誘物（綠線）的情況下遷移通過多孔膜，但當(dāng)化學(xué)引誘物存在于CIM板的下室（紅線）時，巨噬細(xì)胞遷移顯著刺激。圖“B”改編自PLoS One。 2013年3月8（3）：e58744。

實時阻力跟蹤說明

使用稱為細(xì)胞指數(shù)（CI）的無單位參數(shù)報告了由貼壁細(xì)胞引起的電子流的阻抗，其中CI=(時間點n阻抗-不存在細(xì)胞時阻抗）/標(biāo)稱阻抗值。圖3提供了在建立和運行凋亡實驗過程中實時阻抗曲線的通用示例。在細(xì)胞添加到孔中的頭幾個小時之后，阻抗快速增加。這是由于懸浮液中的細(xì)胞脫落，沉積在電極上并形成局部粘連。如果添加的細(xì)胞的初始數(shù)量低，并且在井底上存在空的空間，則細(xì)胞將增殖，導(dǎo)致CI逐漸但穩(wěn)定增加。當(dāng)細(xì)胞達到匯合CI值時，反映了大容量介質(zhì)可接近的電極表面積不再改變的事實。此時加入細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑導(dǎo)致CI降低至零。這是細(xì)胞四舍五入，然后從井底分離的結(jié)果。雖然這個通用實例涉及細(xì)胞融合時的藥物添加，基于阻抗的測定是非常靈活的，并且還可以評估初始細(xì)胞粘附到電極的速率和程度，或細(xì)胞增殖的速率和程度。

圖4.用于建立和運行凋亡測定的通用實時阻抗曲線。 在文中解釋了阻抗曲線的每個階段及其產(chǎn)生的蜂窩行為。

超出上述通用示例，圖5顯示了使用ACEA的xCELLigence 實時無標(biāo)記儀器中的E-Plate采集的實際實時阻抗數(shù)據(jù)。 圖5A顯示了將A549細(xì)胞加入到E-Plate板中的前兩小時的阻抗曲線，其中孔預(yù)先用不同濃度的膠原IV包被。 雖然圖5B顯示了在將HeLa細(xì)胞暴露于GPCR激動劑多巴胺的前幾分鐘內(nèi)發(fā)生的細(xì)胞指數(shù)的變化，圖5C評估在20小時內(nèi)NK細(xì)胞介導(dǎo)的癌細(xì)胞的細(xì)胞溶解。 圖5D突出顯示根據(jù)藥物作用機制可能在細(xì)胞指數(shù)中發(fā)生的變化。

圖5.使用E-Plate板和xCELLigence RTCA儀器獲得的實時阻抗曲線示例。 （A）實時監(jiān)測已經(jīng)預(yù)先涂覆不同濃度膠原IV的E-Plate孔的A549細(xì)胞粘附。請注意阻抗值（細(xì)胞指數(shù)）與顯微鏡中可見的貼壁細(xì)胞數(shù)之間的相關(guān)性。 （B）暴露于不同濃度GPCR激動劑多巴胺的HeLa細(xì)胞的實時阻抗曲線。黑色箭頭表示多巴胺加入的時間。 （C）用于NK細(xì)胞介導(dǎo)的MCF7乳腺癌細(xì)胞溶解的實時阻抗曲線。 （D）暴露于藥物的A549細(xì)胞的實時阻抗曲線顯示各種作用機制。

與細(xì)胞相關(guān)的阻抗

RTCA提供細(xì)胞數(shù)量，增殖率，細(xì)胞大小/形狀和細(xì)胞 - 底物附著質(zhì)量的定量讀數(shù)。由于這些物理性質(zhì)是數(shù)千種不同基因/蛋白質(zhì)的產(chǎn)物，因此RTCA可以為細(xì)胞健康和行為提供非常廣泛的視野。在xCELLigence儀器上已經(jīng)成功地分析了從內(nèi)皮屏障功能和趨化性到絲狀偽足動力學(xué)和免疫細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞溶解的一切。盡管它們的廣泛性，xCELLigence測定仍然能夠詢問非常具體的生化和細(xì)胞現(xiàn)象。適當(dāng)使用對照和/或正交技術(shù)使得可以將阻抗跡線的特征與特定的細(xì)胞/分子現(xiàn)象相關(guān)聯(lián)。